Приложение 4
к МР 3.1.0272-22
ПЕРЕЧЕНЬ ИДЕНТИФИЦИРУЕМЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ SARS-COV-2
В настоящее время (на 10.01.2022) к вариантам ВЭП (VOC) относятся штаммы, принадлежащие к линиям:
— Alpha, B.1.1.7 («Британский»);
— Beta, B.1.351 («ЮАР»);
— Gamma, P.1 линии B.1.1.28 («Бразильский»);
— Kappa, B.1.617.1 («Индийский.1»);
— Delta, B.1.617.2 («Индийский.2»).
— Omicron, B.1.1.529 («Южно-Африканский»)
К вариантам ТДИ (VUI) (на 12.06.2021) относятся:
— AT.1 линии B.1.1.370.1;
— B.1.1.523 (ранее относился к линии B.1.1.451, согласно PANGOILIN)
Ниже приводятся рекомендации по дифференциации вышеуказанных геновариантов с помощью методов (1) фрагментного секвенирования по Сэнгеру отдельных локусов гена, кодирующего S-белок, (2) секвенирования по Сэнгеру полного гена S-белка, (3) полногеномного секвенирования.
Информация о характерных мутациях S-гена для каждой линии приведена в таблице 1.
Таблица 1. Характерные мутации S-гена геновариантов ВЭП и ТДИ.
| Мутации гена S | |
| Alpha, B.1.1.7 | H69-, V70-, Y144-, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H |
| Beta, B.1.351 | D80A, D215G, L241-, L242-, A243-, K417N, E484K, N501Y, D614G, A701V |
| Gamma, P.1 | L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I, V1176F |
| Delta, B.1.617.2 | T19R, E156-, F157-, R158G, L452R, T478K, D614G, P681R, D950N |
| Kappa, B.1.617.1 | G142D, E154K, L452R, E484Q, D614G, P681R, Q1071H |
| AT.1 линии B.1.1.370.1 | P9L, D215G, C136-, N137-, D138-, P139-, F140-, L141-, G142-, V143-, Y144-, H245P, F306I, T307S, V308C, E309R, K310S, G311V, I312L, E484K, N679K, ins_679_GIAL, E780K |
| B.1.1.523 | E156-, F157-, R158-, F306L, E484K, S494P, E780A |
| B.1.1.529 |
1. Алгоритм дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью фрагментного секвенирования по Сэнгеру отдельных локусов гена, кодирующего S-белок.
Дифференциацию геновариантов вируса SARS-CoV-2 по локусам из протоколов Университета Женевы и ARTIC осуществляют в соответствии с таблицей 2, определяя делеции 21765-21770 (делеция HV 69-70), 21991-21993 (делеция Y144), 22287-22295 (делеция LAL 242-244), 21969-21995 (делеция CNDPFLGNY 136-144), замены A21801C (замена D80A), G21974T (замена D138Y), G22132T (замена R190S), A22206G (замена D215G), A22296C (замена H245P), T22917G (замена L452R), C22995A (замена T478K), G23012A (замена E484K), G23012C (замена E484Q), A23063T (замена N501Y), C23271A (замена A570D). Нумерация нуклеотидных остатков приведена относительно референс-штамма hCoV-19/Wuhan/WIV04/2019 (EPI_ISL_402124).
На идентификацию геноварианта B.1.1.7 («Британский») направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R44 или nCoV-2019_72 делеций 21765-21770 (HIV 69-70), 21991-21993 (Y144), а также обнаружение замены A23063T (N501Y) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_76, замены C23271A (A570D) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_77.
На идентификацию геноварианата B.1.351 («ЮАР») направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R44 или nCoV-2019_72 замены A21801C (D80A), а также обнаружение делеции 22287-22295 (LAL 242-244) и замены A22206G (D215G) при секвенировании фрагмента nCoV-2019_73, замен G23012A (E484K) и A23063T (N501Y) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_76.
На идентификацию геноварианата — P.1 линии B.1.1.28 («Бразильский») направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R44 или nCoV-2019_72, замены G21974T (D138Y), а также обнаружение замены G22132T (R190S) при секвенировании фрагмента nCoV-2019_73, замен G23012A (E484K) и A23063T (N501Y) при секвенировании фрагмента F47-Я47 или nCoV-2019_76.
На идентификацию геноварианата B.1.617.1 («Индийский. 1») направлено обнаружение при секвенировании nCoV-2019_76 замен T22917G (L452R) и G23012C (E484Q) для филогенетической линии B.1.617.1 и замен T22917G (L452R).
На идентификацию геноварианата B.1.617.2 («Индийский.2») направлено обнаружение при секвенировании nCoV-2019_76 замен T22917G (L452R) и G23012C (E484Q) для филогенетической линии B.1.617.1 и замен T22917G (L452R), а также C22995A (T478K) для филогенетической линии B.1.617.2.
На идентификацию геноварианта B.1.1.523 направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R45 или nCoV-2019_(72_Left+73_Right) делеции 22029-22037 (EFR 156-158), замен G23012A (E484K) и t23042c (S494P) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_76.
На идентификацию геноварианта AT.1 линии B.1.1.370.1 направлено обнаружение при секвенировании фрагмента F44-R44 или nCoV-2019_72 делеции 21969-21995 (CNDPFLGNY 136-144), а также обнаружение замен A22206G (D215G), A22296C (H245P) при секвенировании фрагмента nCoV-2019_73, замены G23012A (E484K) при секвенировании фрагмента F47-R47 или nCoV-2019_76.
Таблица 2. Список мутаций генетических вариантов вируса SARS-CoV-2, детектируемых при фрагментом секвенировании
| По протоколу Университета Женевы | По протоколу ARTIC v.3 | Генетические варианты SARS-CoV-2 | ||||
| Фрагмент F44-R45, внутренний фрагмент F44-R44 <1> | Фрагмент F46-R47, внутренний фрагмент F47-R47 | Фрагмент nCoV-2019_72 | Фрагмент nCoV-2019_73 | Фрагмент nCoV-2019_76 | Фрагмент nCoV-2019_77 | |
| Делеция HIV69-70, Y144 | Замены N501Y
A570D |
Делеция HIV69-70, Y144 | нет | Замена N501Y | Замена A570D | Alpha B.1.1.7 (Британский) |
| Замена D80A | Замены N501Y
E484K |
Замена D80A | Делеция LAL 242-244
Замена D215G |
Замены N501Y
E484K |
нет | Beta B.1.351 (ЮАР) |
| Замена D138Y | Замены N501Y
E484K |
Замена D138Y | Замена R190S | Замены N501Y
E484K |
нет | Gamma P.1, B.1.1.28 (Бразилия) |
| Замены G142D
<2> E154K <2> |
Замены L452R <3> E484Q | Замена T95I <2>
G142D |
нет | Замены L452R
E484Q |
нет | Kappa B.1.617.1 (Индия.1) |
| Делеция FR156-157 <1>
Замена R158G <1> |
Замены L452R <3>
T478K <3> |
нет | Делеция FR156-157 <1>
Замена R158G <1> |
Замены L452R
T478K |
нет | Delta B.1.617.2 (Индия.2) <1> |
| Делеция EFR156-158 <1> | E484K
S494P |
нет | Делеция EFR156-158 | E484K
S494P |
нет | B.1.1.523 |
| Делеция CNDPFLGNY 136-144 | E484K <1> | Делеция CNDPFL GNY 136-144 | Замена <5> D215G H245P | E484K | нет | AT.1 линии B.1.1.370.1 (северо-западный) <4>, <5> |
<1> Использование праймера R44 из протокола Университета Женевы и nCoV-2019_72_Right из протокола ARTIC v.3 может быть неэффективным для идентификации геноварианта B.1.617.2 (Индия.2)! (праймеры относятся к зоне делеции).
<2> Наличие данных замен и/или делеций является возможным, но не определяющим. Определяющими стоит считать замены в положениях 452, 478, 484.
<3> Идентификация данных замен возможна только при секвенировании фрагмента F46-R47.
<4> В случае геноварианта AT.1 линии B.1.1.370.1 (северо-западный) использование праймера F46 из протокола Университета Женевы может быть неэффективным!
<5> При определении геноварианта AT.1 линии B.1.1.370.1 (северо-западный) использование праймера nCoV-2019_73_Left из протокола ARTIC v.3 невозможно!
Рекомендуемые протоколы исследования с помощью фрагментного секвенирования по Сэнгеру отдельных локусов гена, кодирующего S-белок:
Для амплификации участков, содержащих нуклеотидные замены, необходимые для определения геновариантов вируса SARS-CoV-2, используют олигонуклеотидные праймеры, указанные в Протоколе Университета Женевы (Geneva, December 26th, 2020, Rue Gabrielle-Perret-Gentil 4, 1211 Geneva 14, Switzerland), см таблицу 3.
Таблица 3. Праймеры используемые по протоколу Университета Женевы.
| Обозначение | Последовательность (5′-3′) |
| F44 | TCTCTTCTTAGTAAAGGTAGACTT |
| F46 <2> | CCTTCACTGTAGAAAAAGGAATC |
| F47 | TATCAGGCCGGTAGCACAC |
| R45 | CTAACAATAGATTCTGTTGGTTG |
| R44 <1> | GAATAAACTCTGAACTCACTTTCC |
| R47 | CATATGAGTTGTTGACATGTTCAG |
<1> Использование праймера R44 из протокола Университета Женевы может быть неэффективным для идентификации геноварианта B.1.617.2 (Индия.2)! (праймеры попадают в зону делеций).
<2> В случае геноварианта AT.1 линии B.1.1.370.1 (северо-западный) использование праймера F46 из протокола Университета Женевы может быть неэффективным!
При исследовании проб с низкими значениями Ct <= 20 (высокая вирусная нагрузка) достаточно одного раунда ПЦР с праймерами F44-R44 и F47-R47, обеспечивающими образование фрагментов 570 п.н. и 565 п.н., соответственно.
При исследовании проб с высокими значениями Ct >= 25 (низкая вирусная нагрузка) используется гнездовая ПЦР.
Первоначально проводят амплификацию с праймерами F44-R45 и F46-R47, фланкирующими фрагменты размером 1071 п.н. и 1068 п.н., а затем осуществляют вторую ПЦР с праймерами F44-R44 и F47-R47, где в качестве исследуемой ДНК используют ампликоны, полученные в первом раунде, см. таблицу 4.
Таблица 4. Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании Протокола Университета Женевы.
| Матричный режим | 1 этап | 2 этап | 5 этап | 6 этап |
| 95 °C — 5 мин | 95 °C — 30 с
55 °C — 30 с 72 °C — 70 с 38 циклов |
72 °C — 4 мин | 10 °C — хранение |
В качестве альтернативного способа рекомендуется использовать пары праймеров nCoV-2019_72, nCoV-2019_76 и nCoV-2019_77 из протокола ARTIC v.3 (nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost) (protocols.io), см. таблицу 5.
Таблица 5. Праймеры используемые по протоколу ARTIC v.3.
| Обозначение | Последовательность (5′-3′) |
| nCoV-2019_72_LEFT | ACACGTGGTGTTTATTACCCTGAC |
| nCoV-2019_72_RIGHT | ACTCTGAACTCACTTTCCATCCAAC |
| nCoV-2019_73_LEFT | CAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGT |
| nCoV-2019_73_RIGHT | CACCAGCTGTCCAACCTGAAGA |
| nCoV-2019_76_LEFT | AGGGCAAACTGGAAAGATTGCT |
| nCoV-2019_76_RIGHT | ACACCTGTGCCTGTTAAACCAT |
| nCoV-2019_76_LEFT_alt3 | GGGCAAACTGGAAAGATTGCTGA |
| nCoV-2019_76_RIGHT_alt0 | ACCTGTGCCTGTTAAACCATTGA |
| nCoV-2019_77_LEFT | CCAGCAACTGTTTGTGGACCTA |
Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании Протокола ARTIC v.3 см. таблица 6.
Таблица 6. Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании протокола ARTIC v.3
| Матричный режим | 1 этап | 3 этап | 4 этап | 5 этап | 6 этап |
| 95 °C — 5 мин | 95 °C — 60 с
62 °C — 60 с 72 °C — 60 с 10 циклов |
95 °C — 30 с
60 °C — 30 с 72 °C — 30 с 30 циклов |
72 °C — 5 мин | 10 °C — хранение |
Допустимо также использовать праймеры из иных протоколов, позволяющие проводить амплификацию и последующее фрагментное секвенирование участков генома SARS-CoV-2, содержащих перечисленные нуклеотидные замены.
В качестве замены праймерам R44 из протокола Университета Женевы и nCoV-2019_72_Right из протокола ARTIC v.3 может быть использован праймер CACV_51_R, праймеру F46 из протокола Университета Женевы — праймер CACV_55_F и праймеру nCoV-2019_73_Left из протокола ARTIC v.3 — праймер CACV_52_F (таблица 7).
Таблица 7. Праймеры, рекомендуемые для замены неработающих поаймеров из протоколов Университета Женевы и протокола ARTIC v.3
| Название | Последовательность 5′-3′ | Длина, пн |
| CACV_51_R | GAG GGA GAT CAC GCA CTA AA | 20 |
| CACV_55_F | ATG GAA CCA TTA CAG ATG CTG TAG | 24 |
| CACV_52_F | TGG ATG GAA AGT GAG TTC AGA G | 22 |
2. Алгоритм дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью фрагментного секвенирования полной последовательности гена, кодирующего S-белок.
Для дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью фрагментного секвенирования полной последовательности гена, кодирующего S-белок предлагается использовать тот же алгоритм, что и указанный выше для фрагментного секвенирования отдельных локусов.
Для амплификации полного гена S, необходимого для определения геновариантов вируса SARS-CoV-2, используют олигонуклеотидные праймеры из протокола ARTIC v3, перекрывающие полную нуклеотидную последовательность гена S SARS-CoV-2 длиной 3822 нуклеотидных оснований (позиция в геноме 21562 — 25384 н.о.).
Их последовательности и позиции в геноме, а также длина ожидаемых ампликонов, указаны ниже (см. таблица 8). Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании протокола ARTIC v.3 приведены в таблице 8.
Таблица 8. Нуклеотидные последовательности и позиции в геноме олигонуклеотидных праймеров для секвенирования гена S SARS-CoV-2 (протокол ARTIC v3).
———————————
<*> ВНИМАНИЕ! Структура праймера N 1 (nCoV-2019_72_LEFT_alt) является уникальной, не входит в набор оригинального протокола ARTIC v3 и требует отдельного заказа.
| name | Позиция | seq | length | %gc | Длина ампликона | |
| 1 | nCoV-2019_72_LEFT_alt | 21508 — 21544 | FGAGTTGTTATTTCTAGTGATGTTCTTG | 27 | 33.00 | 530 |
| 2 | nCoV-2019_72_RIGHT | 22014 — 22038 | ACTCTGAACTCACTTTCCATCCAAC | 25 | 44.00 | |
| 3 | nCoV-2019_73_LEFT | 21962 — 21990 | CAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGT | 29 | 31.03 | 384 |
| 4 | nCoV-2019_73_RIGHT | 22327 — 22346 | CACCAGCTGTCCAACCTGAAGA | 22 | 54.55 | |
| 5 | nCoV-2019_74_LEFT | 22263 — 22290 | ACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGC | 28 | 35.71 | 387 |
| 6 | nCoV-2019_74_RIGHT | 22627 — 22650 | GCAACACAGTTGCTGATTCTCTTC | 24 | 45.83 | |
| 7 | nCoV-2019_75_LEFT | 22517 — 22542 | AGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGT | 26 | 38.46 | 386 |
| 8 | nCoV-2019_75_RIGHT | 22878 — 22903 | ACCACCAACCTTAGAATCAAGATTGT | 26 | 38.46 | |
| 9 | nCoV-2019_76_LEFT_alt3 | 22799 — 22821 | GGGCAAACTGGAAAGATTGCTGA | 23 | 47.83 | 413 |
| 10 | nCoV-2019_76_RIGHT_alt0 | 23190 — 23212 | ACCTGTGCCTGTTAAACCATTGA | 23 | 43.48 | |
| 11 | nCoV-2019_77_LEFT | 23123 — 23144 | CCAGCAACTGTTTGTGGACCTA | 22 | 50.00 | 399 |
| 12 | nCoV-2019_77_RIGHT | 23501 — 23522 | CAGCCCCTATTAAACAGCCTGC | 22 | 54.55 | |
| 13 | nCoV-2019_78_LEFT | 23444 — 23466 | CAACTTACTCCTACTTGGCGTGT | 23 | 47.83 | 403 |
| 14 | nCoV-2019_78_RIGHT | 23823 — 23847 | TGTGTACAAAAACTGCCATATTGCA | 25 | 36.00 | |
| 15 | nCoV-2019_79_LEFT | 23790 — 23812 | GTGGTGATTCAACTGAATGCAGC | 23 | 47.83 | 379 |
| 16 | nCoV-2019_79_RIGHT | 24146 — 24169 | CATTTCATCTGTGAGCAAAGGTGG | 24 | 45.83 | |
| 17 | nCoV-2019_80_LEFT | 24079 — 24100 | TTGCCTTGGTGATATTGCTGCT | 99 | 45.45 | 388 |
| 18 | nCoV-2019_80_RIGHT | 24444 — 24467 | TGGAGCTAAGTTGTTTAACAAGCG | 24 | 41.67 | |
| 19 | nCoV-2019_81_LEFT | 24292 — 24416 | GCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGG | 25 | 44.00 | 497 |
| 20 | nCoV-2019_81_RIGHT | 24766 — 24789 | GTGAAGTTCTTTTCTTGTGCAGGG | 24 | 45.83 | |
| 21 | nCoV-2019_82_LEFT | 24697 — 24721 | GGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCT | 25 | 48.00 | 379 |
| 22 | nCoV-2019_82_RIGHT | 25053 — 25076 | TGCCAGAGATGTCACCTAAATCAA | 24 | 41.67 | |
| 23 | nCoV-2019_83_LEFT | 24979 — 25003 | TCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCA | 25 | 40.00 | 390 |
| 24 | nCoV-2019_83_RIGHT | 25401 — 25369 | TTTGACTCCTTTGAGCACTGGC | 22 | 50.00 |
Таблица 9. Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании праймеров из протокола ARTIC v3. <*>
| Матричный режим | 1 этап | 3 этап <*> | 5 этап | 6 этап |
| 95 °C — 30 с | 95 °C — 30 с
55 °C — 10 с 72 °C — 40 с 30 — 35 циклов |
72 °C — 2 мин | 10 °C — хранение |
<*> Данный температурный режим указан для протокола на основе High-Fidelity DNA Polymerase. При использовании других ферментов может потребоваться проведение оптимизации условий реакции.
При невозможности использования праймеров из протокола ARTIC v.3 предлагается использовать альтернативный набор праймеров из протокола ЦНИИЭ (неопубликованные данные) или отдельные праймеры, см. таблица 10.
Таблица 10. Нуклеотидные последовательности и позиции в геноме олигонуклеотидных праймеров для секвенирования гена S SARS-CoV-2 (протокол ЦНИИЭ).
| Название праймера | Позиция | Последовательность 5′-3′ | Длина | Длина ампликона, пн |
| Cacv51_F | 21420 — 21440 | AAG GGG TAC TGC TGT TAT GTC | 21 | 795 |
| Cacv51_R | 22195 — 22214 | GAG GGA GAT CAC GCA CTA AA | 20 | |
| Cacv52_F | 22016 — 22037 | TGG ATG GAA AGT GAG TTC AGA G | 22 | 526 |
| Cacv52_R | 22518 — 22541 | CAA TAG ATT CTG TTG GTT GGA CTC | 24 | |
| Cacv55_F | 22407 — 22430 | ATG GAA CCA TTA C AG ATG CTG TAG | 24 | 585 |
| Cacv55_R | 22971 — 22991 | TAC CGG CCT GAT AGA TTT CAG | 21 | |
| Cacv07_F | 22842 — 22861 | ATG ATT TTA CAG GCT GCG TT | 20 | 637 |
| Cacv08_R | 23072 — 23091 | CCT GTA GAA TAA ACA CGC CA | 20 | |
| Cacv81_F | 23261 — 23282 | AGA GAC ATT GCT GAC ACT ACT G | 22 | 585 |
| Cacv81_R | 23821 — 23845 | TGT ACA AAA ACT GCC ATA TTG CAA C | 25 | |
| Cacv82_F | 23684 — 23709 | TCT AAT AAC TCT ATT GCC ATA CCC AC | 26 | 538 |
| Cacv82_R | 24200 — 24221 | TCC AAC CAG AAG TGA TTG TAC C | 22 | |
| Cacv83_F | 24122 — 24145 | AAG TTT AAC GGC CTT ACT GTT TTG | 24 | 592 |
| Cacv83_R | 24690 — 24713 | ACA TAA GAT GAT AGC CCT TTC CAC | 24 | |
| Cacv84_F | 24587 — 24611 | ACT CAA CAA TTA ATT AGA GCT GCA G | 25 | 585 |
| Cacv84_R | 25149 — 25171 | AAG TTC TTG GAG ATC GAT GAG AG | 23 | |
| Cacv85_F | 24810 — 24833 | ATG ATG GAA AAG CAC ACT TTC CTC | 24 | 666 |
| Cacv09_R | 25281 — 25300 | AAA TCT GAA GGA GTA GCA TCC TTG | 24 |
Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании праймеров из протокола ЦНИИЭ приведены в таблице 11.
Таблица 11. Рекомендуемые условия проведения реакции амплификации при использовании праймеров из протокола ЦНИИЭ.
| Матричный режим | 1 этап | 3 этап <*> | 5 этап | 6 этап |
| 95 °C — 5 мин | 95 °C — 30 с
52 °C — 30 с 72 °C — 60 с 30 — 35 циклов |
72 °C — 5 мин | 10 °C — хранение |
<*> Данный температурный режим указан для протокола на основе Taq-полимеразы. При использовании других ферментов может потребоваться проведение оптимизации условий реакции.
Допустимо также использовать праймеры из иных протоколов, позволяющие проводить амплификацию и последующее фрагментное секвенирование последовательности S-гена SARS-CoV-2.
3. Алгоритм дифференциации генетических вариантов вируса SARS-CoV-2 с помощью проведения полногеномного секвенирования
Для заключения о геноварианте SARS-CoV-2 в исследованной пробе рекомендуется использовать алгоритм классификации PANGOLIN (https://cov-lineages.org/).
Для секвенирования полной последовательности геномов SARS-CoV-2 рекомендуется использовать (на выбор) праймерную панель и протокол подготовки библиотек:
— ARTIC v.3 https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-bbmuik6w
— SCV-2000bp https://www.protocols.io/view/protocol-for-scv-2000bp-a-primer-panel-for-sars-co-bn77mhrn.html
— любые иные праймерные панели и протоколы, позволяющие осуществить амплификацию полного генома SARS-CoV-2″.