Want create site? Find Free WordPress Themes and plugins.

Приложение 7
к СП 1.3.3118-13

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
КОНТРОЛЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАБОТЫ ПАРОВОГО СТЕРИЛИЗАТОРА

  1. Бактериологический контроль работы стерилизаторов проводят после монтажа и ремонта аппаратуры, а также в процессе его эксплуатации (плановый — 2 раза в год и при получении неудовлетворительных результатов контроля).

Контроль эффективности работы стерилизаторов осуществляют бактериологическим методом, используя биотесты на основании гибели спор тест-культуры.

Биотесты представляют собой флаконы из трубки стеклянной для лекарственных средств ФИ/1-5 НС 1 ТУ 64-0709-10-88 (инсулиновые флаконы) или чашечки из алюминиевой фольги (диск размером 14 мм с луночкой-вдавлением от неоточенного края карандаша), содержащие высушенные споры тест-культуры Bac. stearothermophilus ВКМ В-718, помещенные в пакеты из упаковочной бумаги (ОСТ 42-21-2-85). Упакованные тесты нумеруют и размещают в контрольные точки паровых стерилизаторов (5 — 10 тестов). По окончании стерилизации биотесты подвергают бактериологическому исследованию.

  1. Штамм Bac. stearothermophilus ВКМ В-718 — подвижная термофильная палочка, по Граму окрашивается положительно, культивируется при температуре (55 ±1) °C, исключающей развитие других широко распространенных микроорганизмов. Споры овальные, расположенные центрально. На мясопептонном бульоне (pH 7,3 ±0,1) через 24 часа образует помутнение среды, на мясопептонном агаре (pH 7,3 ± 0,1) — слабо выпуклые колонии диаметром 2 — 4 мм с ровным краем. Штамм не патогенен для человека и животных. Штамм получен из Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов, хранится в музее культур НИИ дезинфектологии (117246, г. Москва, Научный проезд, 18).

Приготовление биотеста

В ампулу с лиофилизированной культурой вносят 0,2 мл стерильной водопроводной воды и оставляют на 30 мин. при комнатной температуре.

Одну-две капли культуры засевают в 2 пробирки с бульоном (МПБ, Хоттингера, бульон питательный сухой) с 0,5% глюкозы. Суточную бульонную культуру засевают в пробирки на скошенный агар (Хоттингера, мясопептонный, сухой питательный). Для получения спор культуру, выращенную на твердой питательной среде, смывают 5 мл стерильной водопроводной воды и переносят во флаконы со скошенным картофельно-пептонным агаром. Взвесь покачиванием флакона равномерно распределяют по поверхности среды, инкубируют при 55 °C в течение 10 — 12 суток в наклонном положении агаром вверх. Для создания достаточной влажности в термостат помещают открытые емкости с водой. На 7, 10 и 12 сутки культуру проверяют на интенсивность спорообразования. Достаточным количеством считают 80 — 90% спор в поле зрения. Культуру смывают стерильной дистиллированной водой. В целях освобождения от вегетативных клеток суспензию прогревают на водяной бане при температуре 65 — 70 °C в течение 30 мин., центрифугируют трехкратно с частотой вращения 2 000 об./мин. по 15 мин., промывая осадок стерильной дистиллированной водой после каждого центрифугирования. Отмытые споры суспендируют в стерильной дистиллированной воде в соотношении 1:1 по объему. Суспензию спор хранят в холодильнике при температуре 4 °C в стерильных пробирках, закрытых ватно-марлевыми пробками с резиновыми колпачками (срок хранения 2 года).

Чистоту культуры на всех этапах культивирования контролируют высевом на агаровые пластинки.

Для определения титра жизнеспособных спор 0,1 мл исходной суспензии десятикратно разводят до 10-7  стерильной дистиллированной водой, высевая на 3 агаровые пластинки по 0,1 мл ориентировочно из разведения  10-5 — 10-7  (предел разведения зависит от титра полученных спор). Посевы инкубируют в течение 48 ч, проводят подсчет выросших колоний. Титр жизнеспособных спор в исходной суспензии определяют как среднее арифметическое число колоний с учетом разведения исходной суспензии и объема пробы для посева.

Например, при посеве на три чашки Петри с агаром суспензии в разведении 1:100 000 (105) подсчитано 140, 110 и 134 колонии. Аналогичные высевы из разведения 106 привели к образованию 12, 14 и 16 колоний; из 107  — 5, 3 и 7 колоний. Вычисляем общее число колоний, а затем среднее количество колоний для каждого разведения 128, 14 и 5.

Из расчета посевной дозы (0,1 мл на каждую чашку) вычисляем титр жизнеспособных спор в 1 мл исходной суспензии с учетом разведения, далее находим среднее арифметическое число колоний:

128 · 10 ·105  = 12,8 ·107;

14 · 10 ·106  = 14,0 ·107;

5 · 10 ·107  = 50,0 ·107.

Таким образом, титр исходной суспензии составит:

(12,8 + 14,0 + 50,0) ·107  : 3 = 2,5 ·108  спор в 1 мл.

Исходная суспензия должна содержать не менее 2,5 ·107  — 2,5 ·108  спор в 1 мл. Споры в количестве 5 ·105  — 5 ·106  вносят из исходной суспензии с помощью дозатора пипеточного (ТУ 64-1-3329-81) в 0,02 мл в носители (стерильные инсулиновые флакончики с ватно-марлевой пробкой или чашечки из алюминиевой фольги, разложенные в чашки Петри), подсушивают в термостате при 37 °C или в эксикаторе над осушителем (силикагель, хлористый кальций) при комнатной температуре в течение 24 ч.

Для определения фактической обсемененности исследуют не менее трех биотестов от каждой группы. Во флаконы (чашечки) вносят по 1,0 мл стерильной дистиллированной воды (чашечки из алюминиевой фольги отмывают в широкогорлых пробирках с бусами в 10 мл дистиллированной воды) и встряхивают в течение 10 мин. на аппарате для встряхивания жидкостей с последующим высевом на 3 агаровые пластинки по 0,1 мл суспензии из трех последовательных десятикратных разведений.

  1. Определение устойчивости спор тест-культур к действию водяного насыщенного пара под избыточным давлением проводят при температуре (120 ±2) °C.

Биотесты в упаковочной бумаге помещают в стерилизационной коробке в камеру парового стерилизатора. После набора давления в водопаровой камере (0,11 ± 0,01) МПа (1,1 ± 0,1) кгс/см2 проводят продувку парового стерилизатора (вытеснение воздуха паром из камеры парового стерилизатора) в течение 10 мин. при открытом спускном кране и давлении в стерилизационной камере от 0,01 до 0,02 МПа (от 0,1 до 0,2 кгс/см2). После продувки доводят давление пара в стерилизационной камере до (0,11 ± 0,01) МПа (1,1 ± 0,1) кгс/см2, температура (120 ± 2) °C и через 5 мин. (времени выживания спор тест-культуры) с момента установления давления спускают пар. Для уменьшения времени воздействия пара до и после экспозиции подъем давления проводят максимум в течение 8 мин., спуск — в течение 3 мин.

Аналогичное исследование проводят в течение 15 мин. времени выдержки (время гибели спор тест-культуры). Контроль температуры осуществляют максимальными термометрами. По окончании времени выдержки биотесты вынимают из стерилизатора и проводят бактериологическое исследование.

Партию биотестов считают годными для использования, если показатели устойчивости спор тест-культуры соответствуют вышеописанным требованиям.

  1. Для определения эффективности работы стерилизатора в обеззараженные биотесты и контрольный тест (без стерилизации) стерильно вносят по 5 мл питательной среды, инкубируют при 55 °C в течение 7 суток при ежедневном просмотре посевов, делая высевы на агаровые пластинки из проросших емкостей.

При использовании полусинтетической среды с индикатором феноловым красным рост тест-культуры определяют по изменению красного цвета среды (pH 7,7 ± 0,1) на желто-оранжевый (pH 6,7 ± 0,1) за счет разложения глюкозы с образованием кислоты.

В целях исключения ложного отрицательного результата (при наличии роста тест-культуры отсутствует изменение цвета питательной среды) флаконы (пробирки) должны быть плотно закрыты стерильными резиновыми пробками (N 7,5; 12,5).

Отсутствие роста тест-культуры указывает на эффективность работы стерилизатора. Рост других культур микроорганизмов относят за счет вторичного обсеменения.

При наличии роста тест-штаммов проводится повторный контроль на удвоенном количестве биотестов. Если и при повторной проверке тест-культуры не инактивируются, осуществляют тщательный контроль технического состояния аппарата и контрольно-измерительных приборов. При отсутствии роста тест-культур в контрольном биотесте (не подвергшемся стерилизации) устанавливается причина (нежизнеспособность тест-культуры, несоблюдение методики приготовления биотестов, питательных сред, условий культивирования).

  1. Для спорообразования используют:

— картофельно-пептонный агар (пептон — 5,0, мел — 1,0, агар — 25,0, картофельная вода — 1 000 мл), pH 7,1 ± 0,1. Сырой картофель (200 г очищенного картофеля на 1 л водопроводной воды) тщательно моют, очищают от кожуры и глазков, нарезают мелкими ломтиками, заливают водопроводной водой и кипятят 30 мин. после закипания (молодой картофель употреблять нельзя). Отвар отстаивают и фильтруют в холодном состоянии через ватно-марлевый фильтр. Доводят объем фильтрата до первоначального. Устанавливают pH 7,1 ± 0,1. Добавляют пептон и агар. Нагревают, помешивая до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, после чего добавляют мел. Разливают по флаконам, стерилизуют при 120 °C в течение 30 мин. После стерилизации среду во флаконах скашивают;

— пшеничный агар (пшеничная крупа — 500,0, агар — 25,0, дистиллированная вода — 1 000 мл), pH — 7,3 ± 0,1.

Пшеничную крупу заливают дистиллированной водой. Через 12 ч настой аккуратно сливают, не выжимая, доводят до первоначального объема, добавляют агар и растапливают на водяной бане или в автоклаве (текучим паром 1 ч). Остывший агар выкладывают на противень и срезают осадок. Агар растапливают на водяной бане, постоянно помешивая. Устанавливают pH 7,3 ± 0,1. Разливают во флаконы. Стерилизуют текучим паром по 1 ч в течение 3 суток. После стерилизации среду скашивают.

  1. Для контроля используют бульон Хоттингера pH 7,3 ±0,1, агар Хоттингера pH 7,3 ±0,1, питательный бульон сухой pH 7,1 ± 0,1, питательный агар сухой pH 7,3 ± 0,1, среду питательную для контроля стерильности pH 7,1 ± 0,1, бульон из перевара кровяных сгустков, полусинтетическую среду с индикатором феноловым красным pH 7,7 ± 0,1 (аммоний фосфорно-кислый однозамещенный — NH4H2PO4 — 1,0 г; магний серно-кислый — MgSO4 — 0,2 г, калий хлористый — KCl — 0,2 г, глюкоза — 5,0 г, феноловый красный — 0,02 г, бульон Хоттингера с содержанием аминного азота — 140 — 160 мг — 200 мл, дистиллированная вода — 800 мл), pH 7,7 ± 0,1. Компоненты смешивают и растворяют при нагревании на водяной бане, доводят pH до 7,7 ± 0,1, разливают во флаконы, стерилизуют при 110 °C в течение 30 мин.

Источник — Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 28.11.2013 N 64 «Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)» (вместе с «СП 1.3.3118-13. Санитарно-эпидемиологические правила…») (Зарегистрировано в Минюсте России 19.05.2014 N 32325)

Did you find apk for android? You can find new Free Android Games and apps.
Понравился материал? Будем благодарны за репосты

Ответить

одиннадцать + 17 =